高效中华绒蟹微卫星文库的构建及其七个位点的特征分析

一次富集回收产物与生物素标记探针杂交,运用磁珠亲和捕捉构建中华绒螯蟹微卫星文库。96个阳性克隆双向测序结果为75个克隆含有微卫星,登录号为DQ388769~DQ388807,表明二次富集法是一种快速高效的分离微卫星的方法。7个微卫星位点的特征分析显示,ES10位点是复制位点;ES37可能有空位点;其它5个位点可用于中华绒螯蟹的品种鉴定、遗传多样性和群体结构研究。     

茶树CsWRKYIIcs转录因子的克隆及功能分析

【目的】以’陕茶1号’为材料,克隆CsWRKYIIcs转录因子并分析序列特征,了解其在不同组织和非生物胁迫下的表达模式以及转录活性,为深入研究茶树在逆境胁迫中的功能提供理论依据。【方法】根据茶树基因组数据库注释的WRKY序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术从’陕茶1号’中扩增CsWRKYIIcs的c DNA序列,用生物信息工具分析序列的特点,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)研究基因的表达模式,用酵母试验验证其转录活性。【结果】获得9条CsWRKYIIcs的cDNA序列,开放阅读框长度分别为561、960、936、978、897、912、720、1 008和969 bp,分别编码186、319、311、325、298、303、239、335、322个氨基酸。除了CsWRKYIIc7缺少锌指序列外,其他CsWRKYIIcs均含有1个WRKY保守结构域和典型的C2H2型锌指结构。不同物种中的WRKYIIcs具有相似的保守基序,而茶树CsWRKYIIcs和拟南芥、葡萄等双子叶植物的WRKYIIcs氨基酸序列相似性更高。另外,CsWRKYIIcs启动子区域均预测到多个与非生物胁迫相关的顺...     

茶树CsSPMS基因全长cDNA克隆和时空表达分析

为探究精胺合成酶（spermine synthase,SPMS）与茶树（Camellia sinensis）耐寒性的关系,以茶树品种‘迎霜’为试验材料,利用简并引物PCR扩增技术结合5′/3′RACE方法,获得与低温胁迫相关的CsSPMS片段cDNA全长序列（GenBank登录号为KJ580429）。该序列全长1 374 bp,包含1 113 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码371个氨基酸,预测分子量41.28 kD;构建亚细胞定位载体pJIT166-GFP/SPMS,亚细胞定位结果显示CsSPMS定位在细胞核上。荧光定量PCR分析表明CsSPMS在根、茎、叶、芽、花和果中都有表达,在根、茎中表达量较高;低温胁迫处理下不同组织CsSPMS的表达量,在叶片中2 h达到峰值,而在根中12 h达到高峰;在低温条件下4个茶树品种的耐寒性与CsSPMS表达量密切相关。     

飞机草微乳剂对荔枝蒂蛀虫产卵驱避活性的测定

18%飞机草微乳剂在不同浓度下对荔枝蒂蛀虫产卵驱避的试验结果表明,当药液中飞机草氯仿萃取物含量分别为50、100、150、200、250、300、350、400、450μg/mL时,对荔枝蒂蛀虫产卵驱避率分别为71.86%、77.38%、77.38%、81.01%、84.73%、87.09%、88.54%、90.50%、95.26%,说明试验药液中氯仿萃取物含量越多(即浓度越大),驱避效果越好。从经济的角度考虑,建议18%飞机草微乳剂在实际生产中使用浓度以250μg/mL为宜。     

中华鲟硬组织微结构及微化学的特征探索

为了在中华鲟洄游生态学研究上有新突破,实验首次比较研究了中华鲟3种硬组织(耳石、背骨板和胸鳍条)的微结构和微化学特征.结果 发现,耳石结构松散,存在多个耳砂(微晶球霰石球晶)颗粒,且每个颗粒均具有独立的核心;背骨板存在分层现象;胸鳍条结构较为致密,且均一.胸鳍条、耳石中生境元素Co/Ca、Sr/Ca和Ba/Ca比特征变...     

中华绒螯蟹血淋巴中酚氧化酶的部分生化特性

对中华绒螯蟹血淋巴的血清、血浆和血细胞裂解上清液（HLS）中酚氧化酶（PO）的活力以及该酶最适pH和温度进行了测定分析,结果表明在血清和HIS中都有PO活力,而血浆中无PO的存在,血清中的PO来自于血细胞;以L—Dopa为底物,中华绒螯蟹PO活力的最适pH值为6．5,最适温度为40℃。采用SDS、Ca^2＋、Mg^2＋以及SDS与Ca^2＋联合和SDS与Mg^2＋联合分别对酚氧化酶原（proPO）进行激活试验,血清和HLS中的PO活力都有显著的增加,其中SDS的激活作用最强,Ca^2＋、Mg^2＋的激活作用最弱,SDS与Ca^2＋联合和SDS与Mg^2＋联合的混合激活作用介于SDS和Ca^2＋、Mg^2＋之间,激活试验表明中华绒螯蟹的PO主要以酚氧化酶原（proPO）形式存在于血细胞中。     

茶树CHS基因结构及编码区单核苷酸多态性分析

【目的】通过试验获得茶树CHS基因（CsCHS）gDNA序列,以进一步确定CsCHS基因结构;研究CsCHS编码区单核苷酸多态性,并结合茶树多酚含量进行关联分析,寻找基因中可能存在的与茶多酚含量存在显著或极显著相关关系的SNP位点。【方法】根据NCBI数据库中已有CsCHS序列设计特异性引物,再分别以基因组DNA和cDNA为模板进行PCR扩增,经克隆、测序获得CsCHS1、CsCHS2、CsCHS3三个基因的gDNA和cDNA全长序列,通过序列比对方法确定CsCHS结构。利用Compute pI/Mw、SOPMA等软件对所得序列进行生物信息学分析,预测和比较CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3三者蛋白质结构。以茶多酚含量差异较大的57份茶树品种为材料,分别以57份材料的cDNA为模板,用特异性引物进行PCR扩增,然后利用PCR产物直接测序法筛查CsCHS编码区序列的单核苷酸多态性。结合CsCHS编码区序列单核苷酸多态性和57份材料多酚含量,利用软件TASSEL进行关联分析,筛选基因中可能与茶多酚含量存在显著或极显著相关关系的SNP位点。【结果】试验获得CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3的cDNA序列长度分别为1 277、1 320和1 242 bp,各自均包含一个长度为1 170 bp的开放阅读框;CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3的gDNA序列长度分别为1 600、1 330和1 607 bp。通过gDNA序列和cDAN序列比对,结合真核生物内含子GT-AG法则,确定CsCHS1、CsCHS3分别包含2个外显子和1个内含子,内含子大小分别为323和356 bp,CsCHS2可能没有内含子。根据CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3 cDNA序列推导三者对应氨基酸序列,比较三条氨基酸序列发现三者氨基酸同源性较高,达到92.6%-95.4%,CHS蛋白亚家族中的特征性保守位点在这三条序列中都能找到,生物信息学分析结果显示CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3三者蛋白质结构高度相似。CsCHS1编码区序列中共发现71个SNP位点,SNP出现频率为1SNP/16.48 bp,无Indel,基因核苷酸多样性（π）值为0.01088;CsCHS2编码区序列中共发现55个SNP位点,SNP出现频率分别为1SNP/21.27 bp,CsCHS2核苷酸多样性（π）值（0.00530）明显低于CsCHS1;因扩增CsCHS3 cDNA序列的PCR反应成功率低,未对该基因遗传多样性进行分析。通过关联分析分别从CsCHS1和CsCHS2中找到2个和4个与茶叶多酚含量相关的SNP位点。【结论】CsCHS1和CsCHS3属于保守型CHS基因,且CsCHS1、CsCHS2和CsCHS3蛋白质结构高度相似,推测三者可能在茶树的不同部位或不同生长阶段发挥类似作用;CsCHS1和CsCHS2活跃,二者编码区内可能存在突变热点区。     

中华绒螯蟹蜕皮周期及蜕皮过程中肝胰腺消化酶活性的变化

采用Darch蜕皮周期分期方法,对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的蜕皮周期进行了划分,并初步探讨了中华绒螯蟹蜕皮过程中肝胰腺消化酶活性变化。根据第三颚足末端刚毛和表皮的形态学特征,可将中华绒螯蟹的蜕皮周期分为蜕皮后期(A-B期)、蜕皮间期(C期)、蜕皮前期(D期)和蜕皮期(E期),其中D期可进一步分为D0、D1、D3-43个亚期。在蜕皮过程中,肝胰腺淀粉酶和胰蛋白酶活性在蜕皮后A-B期开始升高,于蜕皮前早期D0阶段达最大(P<0.05),随后又逐渐降低,至蜕皮前晚期D3-4阶段降至最低(P<0.05);胃蛋白酶活力在蜕皮周期中于蜕皮前晚期D3-4阶段显著降低(P<0.05),其他阶段变化不明显(P>0.05)。结论认为,中华绒螯蟹蜕皮过程可分为C、D0、D1、D3-4、A-B 5个时期,蜕皮过程中肝胰腺淀粉酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶活性发生周期性变化。     

中华鲟胚胎细胞的冷冻保存及其核移植

为了保存濒危鱼类中华鲟种质资源,对其囊胚细胞和原肠细胞进行了冷冻保存和核移植试验。用二甲亚砜(DMSO)、1,2-丙二醇(PG)、羟乙基淀粉(HES)3种抗冻剂,配制4种冷冻保护液:CP1(12%D)、CP2(10%P)、CP3(8%D 6%E)、CP4(7%P 6%E),冷冻细胞存活率分别为47.4%±4.7%、64.4%±3.6%、54.7%±4.7%、76.7%±5.7%,CP4保存效果最好,说明添加非渗透型抗冻剂羟乙基淀粉能提高冷冻保存细胞的存活率。比较了两种冷冻方法,发现细胞在-7℃平衡30min之后直接投入液氮的一步冷冻降温法是可行的。对不同发育时期的胚胎细胞冷冻存活率进行了比较,结果表明原肠细胞冷冻存活率(64.4%±11.8%)明显比囊胚细胞的(57.1%±11.2%)高(P<0.05)。用冷冻复苏后的囊胚细胞和原肠细胞作供体,以中华鲟未受精卵作受体进行核移植,各移植了469和392枚卵,分别获得了5尾和2尾克隆鱼,核移植成功率分别为1.1%和0.5%。表明可通过冷冻保存胚胎细胞结合核移植技术保存鱼类种质资源。     

中华绒螯蟹肝胰腺白化症组织病理变化

采用常规石蜡切片技术和透射电镜技术,对患有肝胰腺白化症的中华绒螯蟹病变组织和细胞进行观察。发现病蟹肝胰腺、鳃、肌肉等组织细胞发生了不同程度的病变,其病理特征为肝细胞水肿、变性、坏死,细胞中脂肪颗粒锐减,线粒体水肿、嵴消失、形成空泡,内质网、溶酶体解体成小泡。鳃组织增厚,上皮细胞微绒毛排列疏松、不规则,部分线粒体嵴消失,出现膜性退化。坏死的肝细胞和鳃上皮细胞中出现细菌颗粒。肌细胞的病变主要表现为细胞核固缩,肌丝松驰、水肿、断裂、肌质网溶解形成小泡。中华绒螯蟹具有重要生理功能的肝胰腺、鳃组织发生了严重病变,使其功能损伤,不耐运输;而肌肉的松驰、肝胰腺脂肪的锐减影响了中华绒螯蟹的品质。同时,病变组织和细胞中未见病毒等生物病原,表明该病为非生物性疾病。图2表0参12